PCR儀是分子生物學(xué)、臨床診斷與病原檢測中的核心設(shè)備，通過實時監(jiān)測熒光信號，實現(xiàn)對核酸模板的精確定量與擴增分析。其結(jié)果準(zhǔn)確性高度依賴規(guī)范的操作流程。任何細微偏差，如樣本污染、程序設(shè)置錯誤或耗材不匹配，都可能導(dǎo)致假陽性、假陰性或數(shù)據(jù)重復(fù)性差。掌握
PCR儀的正確使用方法，是保障實驗科學(xué)性與可靠性的關(guān)鍵。
一、實驗前準(zhǔn)備：環(huán)境與耗材合規(guī)
實驗室分區(qū)：嚴(yán)格遵循“試劑配制區(qū)→樣本處理區(qū)→擴增區(qū)”單向流，避免交叉污染；
耗材選擇：使用儀器兼容的光學(xué)平蓋PCR管/板（如0.2mL8聯(lián)管或96孔板），確保透光率高、熱傳導(dǎo)均勻；
試劑預(yù)混：MasterMix在冰上配制，輕柔混勻，避免氣泡；離心短暫甩液，確保液體沉底。
二、樣本加載與密封
加樣精準(zhǔn)：使用校準(zhǔn)移液器，每孔體積一致（通常10-20μL），避免掛壁或溢出；
密封嚴(yán)密：蓋緊光學(xué)平蓋或使用專用封板膜，防止蒸發(fā)導(dǎo)致濃度變化；
避光操作：熒光染料對光敏感，加樣后盡快放入儀器。
三、程序設(shè)置科學(xué)合理
標(biāo)準(zhǔn)三步法：
預(yù)變性：95℃30-120秒（激活熱啟動Taq酶）；
循環(huán)擴增：95℃5-15秒（變性）→60℃30-60秒（退火/延伸+熒光采集）；
循環(huán)數(shù)：通常40-45cycles；
熔解曲線分析（SYBRGreen必做）：65℃→95℃，每0.5℃讀取熒光，驗證擴增特異性；
避免過度循環(huán)：超過平臺期將降低定量線性范圍。
四、儀器操作規(guī)范
校準(zhǔn)與驗證：定期進行溫度均一性與熒光校準(zhǔn)（按廠家建議，通常每6個月）；
放置位置：PCR板居中放置，確保所有孔受熱與檢測條件一致；
運行中勿開蓋：防止溫度驟降與熒光信號丟失。
五、數(shù)據(jù)分析與質(zhì)控
設(shè)置對照：必須包含無模板對照（NTC）、陽性對照及內(nèi)參基因；
閾值設(shè)定：自動或手動調(diào)整Ct閾值線，位于指數(shù)擴增期起始段；
重復(fù)性要求：技術(shù)重復(fù)Ct值差異應(yīng)≤0.5，否則需排查加樣誤差或模板降解。
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